摘要：PCR實驗，即臨床基因擴增實驗，是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段

 PCR實驗，即臨床基因擴增實驗，是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段。它可以通過將病毒體內所含的基因進行擴增的方法，測出一些病毒含量不高的感染者體內是否含有特定的病毒。

而三級綜合醫院不具備核酸檢測能力的少之又少，大多已經實現了PCR實驗的基本要求，差別只在于開展項目略有不同，這項要求真正難以落實的主要問題是：二級醫院/縣醫院建立PCR實驗室不容易。

就新冠病毒核酸檢測來說，RT-PCR是目前使用廣泛和較準確的篩選和確認方法，大規模核酸檢測，必然會引起相關機構單位著力建設規范的臨床PCR實驗室。但是，建立一個PCR實驗室，其實就是在建設一個平臺，考驗的不僅僅是一個醫療機構的實驗能力，也考驗著整個醫療機構的整體能力。下面，筆者就為大家整理一下PCR實驗室建設及日常管理方面的一些問題。

 

一、臨床基因擴增檢驗實驗室設計的核心問題是什么？

實驗室的平面布局、空調通風 系統設計、氣流控制等都是圍繞同一個核心問題進行——“避免污染”，任何級別的醫院在建設PCR實驗室時，均需要提前考量各個因素，以保證標本的全環節質量及實驗室的生物安全。

1、建設要求。PCR實驗室的建設需要設置標準的“四區”：試劑準備區、標本制備區、PCR擴增檢測區和擴增產物檢測區。每個獨立實驗區設置有緩沖區，各區通過氣壓調節，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染，并降低擴增產物對人員和環境的污染。

2、人員要求。進入PCR實驗室，需要經過從基礎理論、實驗原理、規范操作、質量保證到注意事項等規范的培訓，并獲取PCR上崗證。

3、檢測風險。檢測過程中，樣本的開蓋，核酸提取的震蕩、離心都有可能產生氣溶膠，有感染的風險。

4、防護要求。必須按照生物安全三級實驗室的個人防護要求進行。

 

二、PCR實驗的污染來源都有哪些？

1、樣本間交叉污染：收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴導致外溢；不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖；移液器等實驗器具及耗材未及時消毒滅菌；不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復吹吸導致氣溶膠形成擴散，相互交叉污染。

2、實驗試劑污染：主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中，由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。加樣過程中，因為PCR試劑對溫度十分敏感，需要通過冰浴使得PCR試劑和PCR板/管處于0℃，但這個過程也充滿污染風險。

3、擴增產物污染：大量拷貝的產物泄漏或擴增后的PCR反應管意外開蓋，這是PCR反應中主要、常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大，遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可形成假陽性。

4、克隆質粒污染：作為陽性質控品的克隆質粒外溢。

 

三、防止實驗污染都有哪些措施？

對于低流行地區，PCR檢測人員經過嚴格培訓上崗后，核酸污染的風險相對較小，但在疫區超負荷工作時，就可能會遇到核酸污染的問題，可通過以下措施降低污染機會：

1、正確佩戴手套：手套未緊密貼合拇指、食指和中指，在進行開蓋操作時容易發生交叉污染。

2、正確使用生物安全柜：簡單、整潔、避免通風口堵塞；操作前后紫外線照射，消毒劑隨手可及；廢液缸里有1/3體積的含氯消毒液，并且及時清理廢液缸，保證廢物不超過廢液缸體積的2/3。

3、核酸提取儀去污染：每天多批次檢測時，在每一批次檢測完以后必須用75%的乙醇和核酸去除劑對儀器進行去污染。

4、重視通風：不定期對房間進行通風，每次至少持續30min。

5、PCR擴增區去污染：PCR反應管必須蓋緊，避免擴增后的核酸對環境的污染。

6、實驗室隨手可及的消毒劑。

 

四、PCR實驗室的空氣流向管理與環境消毒？

前面提到，PCR實驗室可分為試劑準備區、標本制備區、擴增區和產物檢測區四個區域，這四個區域在物理空間上必須完全相互獨立，各區域無論是在空間上還是在使用中，應當始終處于完全的分隔狀態，不能有空氣的直接相通。所以，臨床基因擴增檢驗實驗室的空氣流向應按：試劑準備區→標本制備區→擴增區→產物檢測區，應時刻防止擴增產物順空氣氣流進入擴增前區域。可按照上述順序區域空氣壓力遞減的方式進行，也可通過安裝排風扇、負壓排風裝置或其他可行方式實現。

臨床基因擴增檢驗實驗室的環境清潔：《臨床基因擴增實驗室工作規范》中有對物表清潔、消毒的要求，不同的實驗區域應當有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

（1）基本原則：由清潔區向污染區進行，潔具不可交叉。

（2）清潔消毒方向：準備區→標本制備區→擴增區→產物檢測區。

（3）清潔消毒范圍：工作區域的物體表面(含桌、椅)，可使用含氯消毒劑擦拭消毒，空氣和工作臺面可使用紫外線照射消毒，也可使用空間消毒器進行全環節消毒。不可使用紫外線消毒器及化學消毒進行有人狀態下的消毒。PCR室內的消毒應防止揚塵（減少人員走動）、殺滅DNA或RNA的基因片段。可選擇懸掛紫外線燈管進行空氣消毒，試驗前照射30-60分鐘，實驗結束照射30-60分鐘，必要時延長照射時間（可照射一夜）。

（4）終末消毒：當出現實驗室污染時，應按要求立即撤出相關人員，在無人情況下可使用化學消毒劑進行終末消毒，如熏蒸法：過氧乙酸1g/ m³加熱熏蒸（濕度70-90%），密閉24小時；氣溶膠噴霧：3%過氧化氫：20mL/m³氣溶膠噴霧；5%過氧乙酸2.5mL/m³氣溶膠噴霧（濕度20-40%）。

 

五、日常清潔消毒應該如何做？

1、每日工作前后，對工作區域表面、地面進行清潔并消毒，使用含氯消毒液擦拭。清潔采用濕式、不揚塵的方式進行。

2、物品防塵存放。墻面定期清潔，有可見污染及時進行清潔消毒。配備移動紫外線消毒裝置進行空氣和物表的消毒。

3、生物安全柜的消毒：

（1）每天工作前：對生物安全柜的內表面進行消毒，包括工作臺面和內壁使用消毒劑擦拭；

（2）工作結束：柜內物品全部消毒后移出。消毒劑擦拭臺面四周、以及玻璃內側燈部位；

（3）停用生物安全柜前：運行5min以凈化內部空氣；

（4）消毒劑應選擇能夠殺死生物安全柜里可能發生的任何微生物（70%乙醇、含氯消毒劑）。在使用漂白劑等腐蝕性消毒劑后，還應用無菌水再次進行擦拭；

（5）終末消毒：需要進行終末消毒的時機。

 

六、試驗完成后，物品及環境如何處理？

（1）做好廢液及固廢處理；

（2）實驗室空間消毒：在室溫，50-60%濕度條件下，使用過氧乙酸熏蒸2g/m³，過夜；或使用20g/l氣溶膠噴霧，用量8g/m³；

（3）物體表面消毒液：0.55%含氯消毒劑，現用現配，24小時內使用。